光绪三十四年（1908年），慈禧太后先病倒了。而之后不久，光绪帝也神秘地得病，卧床不起。这年十月十八日，一位叫屈桂庭的医生进宫为光绪帝治病，发现光绪帝本已逐渐好转的病情却突然恶化，还在床上乱滚，大叫肚子痛。3天之后，光绪帝就驾崩了。
相比之下慈禧太后临死前不久，神志仍然十分清醒。军机大臣张之洞此时还建议慈禧发布上谕。其中包括：立醇亲王载沣之子溥仪入承大统为嗣皇帝，封醇亲王载沣为摄政王。而在知道光绪皇帝驾崩之后，慈禧太后便又下谕让溥仪继承皇位。由于“嗣皇帝尚在冲龄，正宜专心典学，著摄政王载沣为监国，所有军国政事悉秉予之训示，裁度施行”。就在谕旨发出去后不久，也就是光绪皇帝驾崩后一天的下午，这个掌控光绪一生一世的慈禧太后也随之去世了。
光绪和慈禧两位冤家似的人物，在如此相近的时间内纷纷去世，再加上两人生前不共戴天，光绪之死随之引起了许多学者的关注。光绪到底是自然死亡还是死于谋杀？
有人认为，年事已高的慈禧太后怕自己一死，光绪皇帝会重新掌权来报复自己，于是便想办法害死了他。据著名文献学家、书画家启功所说，启功的曾祖父曾亲眼看到太监给光绪送慈禧太后赏赐的塌喇（即酸奶）。而在这之后不久，光绪皇帝就驾崩了。从医生屈桂庭的看病结果来看，也说明光绪皇帝的病情本已好转，只是不明原因的突然恶化。因此，启功怀疑是慈禧用下了毒的酸奶毒死了光绪皇帝。
也有人说毒死光绪的是李莲英，而不是慈禧。根据《清室外记》记载，李莲英平日里经常中伤和作弄光绪帝，由于怕慈禧死后，光绪重新掌权对自己不利，所以先下手为强，用阴谋害死了光绪皇帝。英国人普兰德所著的《慈禧外传》和德龄所写的《瀛台泣血记》等书也认同此说法。
20世纪30年代，军阀混战，光绪皇帝的陵墓曾一度被军阀炸开。对光绪的遗体进行研究，同时通过分析档案馆所藏的清官脉案中光绪皇帝的病案，得出结论，证明光绪皇帝就是病死的。而他和慈禧太后先后而死，只不过是历史的巧合而已，并没有是什么内幕消息。
但是，这一结论后来被推翻了。2008年11月，国家清史工程编纂委员会主持的“清光绪皇帝死因报告会”在北京举行。这次报告会，公布了一份采用现代刑侦和高科技手段检测的1万字报告，证实光绪确死于砒霜中毒。至此，光绪的死因百年谜案终于获解。
不过，到底是谁下毒杀死了光绪却还需要进一步的调查才能揭开谜底。