天正10年(1582年)，织田信长消灭了甲斐的武田氏，统一天下指日可待。5月，负责中国攻略的羽柴秀吉军面对国安芸毛利氏40000大军，向信长发出援兵请求。5月15日到17日之间，明智光秀负责招待长年与武田胜赖交战的德川家康。织田信长召唤德川家康到安土城晋见，据说当时由于光秀办事疏忽，被解除了招待的负责人职务。15日羽柴秀吉传来求援的消息，17日织田信长命令光秀返回其属地阪本城并准备出战。5月26日，光秀领军来到丹波龟山城，做好了出战的准备。28，29日，他参拜了爱宕神社，并留下了“时在今日，天下当倾(时は今、雨が下しる、五月哉)”的名句。
天正10年(1582年)6月1日，信长援军35000人出阵，其中包括出阵出云、石见的明智光秀军;自己仅带不到100人，从安土城出发，当夜织田信长下榻京都本能寺，召来国手日海和尚(即本因坊算砂)和鹿盐利玄对弈为戏。据说此局下出了罕见的三劫连环无胜负局，包括信长在内，观者皆惊。当日晚间，信长召来长男信忠欢宴，宴后信忠返回妙觉寺就寝。此时已有谋反之心的明智光秀回到居城和手下重臣斋藤内藏介利三、明智左马介光春等商议，认为自己取代信长的时机已经成熟。当夜，明智军13000余人出阵。第一队大将明智左马介光春四天王但马、村上和泉、三宅式部、妻木主计3700人第二队大将明智治左卫门藤田伝五郎、并河扫部介、伊势与三郎、松田太郎左卫门约4000人本队总大将明智光秀明智十郎左卫门、荒木山城守、荒木友之丞、诹访飞騨守、斋藤内藏介、奥田宫内、御牧三左卫门3200余人天正10年(1582年)6月1日半夜，明智军到达京都。明智左马介光春攻织田信长泊宿的本能寺，明智治左卫门攻二条城和织田信忠泊宿的妙觉寺，明智光秀坐镇三条堀河。本能寺更是被重重包围，第一重四天王但马，第二重村上和泉，第三重三宅式部;且本能寺周围所有的出口都有2~300人负责把守。6月1日子时，明智军完成包围工作。听到四周的动静后，小姓们开始骚乱。信长最初还以为是侍卫们吵架，刚才爬起身准备斥责，(就像当初今川义元遭遇偷袭时一样)忽听铁炮发射之声，阵阵鸣响--
“定然有人反叛，去，看看叛者是谁?!”信长命令小姓森兰丸说。森兰丸出去了一会儿，匆匆跑回禀报：“是桔梗旗印，像是惟任日向守的部队!”信长大惊：“光秀吗……”“一定会失败”兰丸所指的，正是信长麾下大将明智光秀，他当时官位为正六位下日向守，因曾通过信长向朝廷求得“惟任”的古老姓氏，因此习惯被称为“惟任日向守”。知道明智光秀谋反后，织田信长亲自上阵，率小姓众奋战，但始终是寡不敌众。御马屋附近马郎、藤八、岩、新六、彦一、弥六、熊、小驹若、虎若等二十四人战死;御殿内小姓森乱、森力、森坊兄弟三人、小河爱平、高桥虎松、金森义入、菅屋角藏、鱼住胜七、武田喜太郎、大冢又一郎、狩野又九郎、蒲田与五郎、今川孙二郎、落合小八郎、伊藤彦作、久々利龟、种田龟、针阿弥、饭河宫松、山田弥太郎、祖父江孙、柏原锅兄弟、平尾久助、大冢孙三、汤浅甚介、小仓松寿等战死。织田信长见大势已去，切腹自杀，但奇怪的是在本能寺内竟然没有人找到信长的尸体。信忠率本队1500人前往救援其父失败，于京都二条城内自杀。就是这短短两三个小时改变了整个战国的历史。光秀之谋叛，普遍认为是临时起意，策划时间并不很长，但即便如此，以后事倒推，似乎也隐藏着许多不为当时人重视的蛛丝马迹。
在受命西援羽柴秀吉，与毛利军对战后，明智光秀从安土返回自己的本城--近江坂本，五月二十六日再到丹波龟山。翌日，他前往爱宕山参拜，祈祷获胜。二十八日，在爱宕山威德院西坊中，召来著名的连歌师里村绍巴等饮酒唱和，这就是著名的《爱宕百韵》。当时光秀所做的连歌中有一句为“ときは今天が下しる五月哉”，意为：“这细雨绵绵的五月天啊。”然而，土岐在日语中的发音正是“とき”，而明智光秀即出身于土岐氏庶流，如果“とき”确为双关语的话，即可解释成：“五月间，土岐氏取得了天下!”
据说连歌唱和时，光秀曾询问里村绍巴本能寺外濠沟的深浅，绍巴回答说：“只是普通寺庙，无濠--将军问此何意?”光秀笑笑，随即闭口不语。但他分明在进行凝重的思索，以致于吃粽子的时候，竟然出神得忘了剥除粽叶。当晚，光秀与绍巴同榻而眠，辗转反侧，隐有叹息声，绍巴问他，他却说是在思索诗句。
六月一日，明智光秀返回龟山城，在此召集麾下最亲信的部将明智左马助秀满(光春)、明智右卫门尉光忠、藤田傅五、斋藤内藏助利三、沟口胜兵卫茂朝五人，说明自己的决心。并且直言相告：“如有异意，请斩光秀之首。”五人皆拜伏应允，并草就誓书、递交人质以表示自己的诚心。
当日下午四时左右，明智光秀召集家中物头，告知说：“京都的森乱(即森兰丸)有信使来报，主公为了加强对中国地区用兵，要在京都检阅我家的军队。”于是立刻整队出发。但还有一种说法，明智军是先西进到山崎后，光秀才宣布“阅兵”的消息，于是大军转向前往京都。对于明智光秀的真实意图，普通士兵们是不了解的，他们也并不知道“阅兵”的借口，甚至其中许多人等到信长死亡，还搞不清内中真相。最先攻入本能寺的士兵之一、本城揔右卫门有介在回忆录中说：“那时，太合公(即羽柴秀吉)正在备中与辉元殿下对峙，明智率军驰援，本以为是前往山崎方向，不料却命令进京。因为那时家康公也到了京都，我等都认为这是针对家康公的。”
士兵们认为是信长想要消灭德川家康势力，因此派明智光秀趁夜秘密进军前往京都。这可见即便最下层的兵卒，对于他们的领袖织田信长都报有一种怎样的观感--信长公是强大的君主，但他毫无信义，诛杀甚至谋杀盟友，对他来说并非不可理解之事。《耶稣会日本年报》中也说：“……命令把火绳都点了火，铳都上了扳机，长枪也整备好。部下疑惑这是打算做什么，有人认为明智受信长的命令，去杀信长的义弟三河之王(指家康)”。其实当时家康已经去往了堺，而并不在京都。
据说明智军总兵力为一万三千人，分为三队：光秀本队自保津翻山，经水尾天皇陵至嵯峨野，在衣笠山麓的地藏院布阵;一队由明智秀满等率领，由山阴道经过老之坂，渡过桂川;另一队由明智光忠率领，从王子村取道唐柜岳，前往松尾的山田村。一方面，万余大军如果不分散行动，踪迹是不可能不被发现的，另方面，这说明光秀的目的并不仅仅在杀死信长一人，他还要趁此机会尽快控制京都和附近地区。
明智本队进入山城国，在沓挂宿稍作休息时，光秀命令部将天野源右卫门领一队人马为先驱，将此地到本能寺路上有可能泄露本军行踪的行人全部捉拿或诛杀。天野源右卫门果然在京都七条口附近杀死了早起种瓜的二、三十个农民。
明智大军进至桂川时，光秀终于下达了详细的命令：“都去掉马蹄上包裹的东西，士卒脱掉草鞋，换上足半，铁炮手把火绳切成一尺五寸长，并将两端都点燃。随时准备战斗!”渡过桂川后，他鼓舞士兵说：“从今日起，光秀殿下即将成为天下人，即便如提鞋的低贱之辈亦当欢欣踊跃，竭尽忠勇。吾辈士卒有两处目标(指信长下榻的本能寺，和信忠下榻的妙觉寺)，树立武勋便在今日。有什么愿望现在尽可以说出来。有兄弟子嗣之人自不必担心无人继承家业，无兄弟子嗣之辈尽可从自己的亲属中选出关系亲近者继承家业。众人封赏之高下，全系尽忠之深浅!”然后一指远方：“前进，敌在本能寺!”