尊攘派由于萨、长两藩实行攘夷，声势大振。长州藩策动各藩志士浪人联系皇室公卿，迫使朝廷亲征外夷，压制反对者。于是朝廷于公元1863年8月13日宣布孝明天皇将到奈良参拜神武天皇陵召开军事会议后祈祷攘夷。但孝明天皇仍倾向公武合体派。他表示：“权力下移，终至颠覆治国之基，联深忧之。”公元1863年8月，他和上层公卿串通幕府和萨摩、会津的藩士，发动了“8月18日政变”，尊攘派毫无准备，措手不及。长州藩的久扳玄瑞、桂小五郎(木户孝允)和土佐藩的土方允元等，偕同三条实美等开明派公卿7人逃出京都，退往长州。尊攘派势力被清除出京都。
各藩尊攘派武士豪农纷纷起义，但因没有取得广大民众支持，被幕府镇压。公元1863年12月，天皇任命公武合体派大名一桥庆喜、松平庆永、松平容保、山内容堂、伊达忠诚、岛津久光为参预，组成参预会议，共议国策，公武合体派控制了中央政局。政变后，各藩的尊攘运动也遭挫折。土佐藩士武市瑞山等被前藩主山内容堂逮捕入狱，并在公元1863年5月令其切腹(见上节)。土佐勤王党的其他人员坂本龙马和中冈慎太郎被迫逃离本藩。长州藩保守派卷土重来，控制了藩政，公元1863年底，下令限制“诸队”人数，禁止农兵队训练。聚集在长州的藩内外尊攘派急于扭转颓势，公元1864年6月，久留米神官出身的真木和泉及久坂玄瑞不顾高杉晋作等人反对，带兵前往京都。同年7月19日进攻宫廷，在右蛤御门(皇宫西门)被松平容保(幕府京都守护)指挥的会津、萨摩两藩兵击败，真木及久坂自杀(“禁卫门之变”)。至此，尊攘运动事实上已经终结，中央和各藩的政局表面上都受公武合体派控制。
由于“禁门之变;，长州藩和尊控派被视为叛逆。公元1864年7月，天皇下令由幕府征伐长州藩。幕府纠集中国、四国、九州的35藩兵力，准备粉碎反幕势力的基地。英国殖民主义者决定利用这一机会对公元1863年5月长州炮击外船的行动实行报复，克服尊攘派阻挠对日贸易的难局，并夺取新的权益。英国于公元1864年8月5日联合美、法、荷舰队，以战舰17艘、炮288门、兵5000余，大举进攻关门海峡。奇兵队和人民英勇抗战，但藩政府丧失斗志，四国舰队仅3天就功陷下关(“下关战争”)。8月13日长州藩被迫接受和议：1、优待并供应通航海峡的外国船只;2、不准修复和新建海峡炮台;3、赔尝联军战费和未烧下关市区的代价300万美元，但应由发出攘夷命令的幕府负担。下关战争的结果，迫使日本对外政策从攘夷转向开国。
下关战争后，围绕对幕府征讨长州藩应持方针的问题，长州藩保守派上级武士与尊攘派的斗争激化，保守派主张向朝廷、幕府“恭顺谢罪”，而凭借“奇兵队”等“诸队”(新军)力量的高杉晋作、井上馨、伊藤博文等则力主“武备恭顺”，即表面顺从幕府，如幕府想处罚长州藩，则准备抗战。同年9月末的藩政会议上，“武备恭顺”主张渐占上风。但这时幕府和长州藩保守派势力抬头，保守派见势不妙，便诉诸恐怖行动，以刺客袭击井上馨，负重伤后监禁了他。高杉晋作与伊藤博文被迫逃往筑前。当11月幕府征长军逼近长州时，藩政府命令“禁门之变”的责任者3名家老自杀。藩主毛利敬亲请求宽大处分，幕府命毛利父子：1.呈交亲笔谢罪状;2.破毁山口城堡;3.将三条实美等公卿送交筑前藩。毛利敬亲都接受了。其他各藩尊攘派在反动势力下都被镇压，或死或逃，幕府第一次征长战争便告结束。二、长州藩转向倒幕开国
“8月18日政变”和以后一系列事件证实了久坂玄瑞在1862年的预言——“诸侯不足恃，公家不足侍”，使尊攘派认识到，依赖保守庸愚的天皇攘夷是不行的。尤其在同殖民主义者直接交锋后，更了解到不根本推翻腐朽的幕藩体制，摆脱封建束缚，发展先进科学技术，建立富强的近代民族国家，决不能克服民族危机，只有倒幕才是挽救日本的先决条件。以后，尊授派以中国在鸦片战争后，因积弱而被列强宰割作为教训，决定奋起自强。自强首先要振兴工商业，实行开国，扩大对外贸易，以集中政治军事资金。支持尊攘派的西南豪农富商在开港后企图发展独立自主的经济，也要求放弃盲目排外政策。在此以前，尊攘派为攘夷而尊王。攘夷是中心口号。到了此时，根本战略应由攘夷转为倒幕，并为倒幕而要求开国，于是放弃了攘夷论。就这样，尊攘派变成了倒幕派、这是幕末政治斗争形势的第二次转变。
随着人民反封建斗争的高涨，倒幕派下级武士在包括地主富商等阶层的革新势力中树立了更坚实的领导权。他们已不再仅仅依靠“草莽崛起”，而致力于依托西南各藩的“割据富强”，壮大倒幕实力。
倒幕浓首先控制了长州藩，和上层豪农商结成同盟，通过他们，动员群众，组织到人民武装(诸队)中来。公元1864年12月，高杉晋作等潜返下关，指挥伊藤博文等率领的诸队，发动了夺取藩保守派权力的内战。濑户内海沿岸的豪农商支持新军的斗争，抵制保守派解散诸队的命令。小郡农兵队创建者豪商秋本新藏鼓励高杉晋作和兼重让藏说：“假若你们的部下不能取胜，新藏就发动农民起义，来恢复国家(指藩)，无论出现任何事情，请兼重先生都不必顾及。”象这样的草莽志士(豪农商、村长、教师、僧侣、神官等)在各地发挥了很大的宣传动员作用。他们牺牲一切，为爱国倒幕组织各种民兵队，参加到新军里来。庆应元年(公元1865没)2月，倒幕派获胜，重掌长州藩权力。
高杉晋作和木户孝允进行“割据富强”的改革。他们录用农村医生出身精通西方军事的大村益次郎(公元1824年—公元1869年)改革军制：一律更换新兵器;解散旧式军队，编成近代步炮兵，大名和藩士的家臣兵卒都脱籍参加;解除主从关系，更吸收农商出身青年，受新式军事训练;“奇兵队”等则作为新军基干，全部纳入藩政府控制下。另一方面，藩厅为防范群众，又组织以“世禄之士”为中心的“干城队”，并禁止组织新的农兵队，显示倒幕派武士的局限性。在改革军制的同时，从公元1865年10月起，藩政府新建了造船、冶铁、炼油等藩营手工业工场。早在公元1864年下关战争失败后，长州舆论已倾向“开国”。实行军事改革和增强军备，需要大量输入西洋武器，于是扩大商品经济和对外贸易。长州和一些外商不顾幕府禁令，进行下关至上海的秘密贸易。在此期间，长州藩与英国逐渐接近。长州藩的“庆应改革”，形式上仍象过去的藩政改革，但实际上已包含了否定幕藩体制原则，积蓄倒幕的物质力量，预示以后明治政府采取的方向。