1940年9月27日由纳粹德国、法西斯意大利与大日本帝国在德国柏林签署了《德意日三国同盟条约》。此项协定正式确立了上述三个轴心国的同盟关系。
条约补充1936年的德日协定和反共产国际协定之不足，并消除德国与日本因1939年苏德互不侵犯条约而起的嫌隙。后来，匈牙利(1940年11月20日)和罗马尼亚(1940年11月23日)加入协定。
经过一番长时间的谈判，该条约的签字仪式在柏林举行，德国外交部长约阿希姆·冯·里宾特洛甫，意大利外长加莱亚佐·奇诺，日本特命全权大使来栖三郎最终签订了该条约。
随后在1941年12月11日，德意日三国又补充签订了《德意日三国不单独媾和协议》，作为回应，1942年1月，中美英苏四大国发表了《联合国宣言》。标志着第二次世界大战正式进入同盟国与轴心国两大阵营对抗的时期。
德意日三国签订该协议后，日军开始着手进行对苏战备，德国威胁美国必须保持中立。
协议签订后，日本大街小巷挂满三国国旗庆祝。
9月28日的日本朝日新闻头版头条报道了三国同盟的签订。