文久二年(1862年), 近藤一度获得了讲武所剑术教授的机会。不过终因农民出身的身份而没有被正式采用。
文久三年(1863年)，率试卫馆天然理心流门人加盟进京浪士组。浪士组解散后残留京都，成为京都守护松平容保下属，并与芹泽鸭一派共同成立“新撰组”。响应幕府号召，募集浪人组织新撰组，暗杀前辈和同僚，肃正芹泽鸭与新见锦一派后，近藤勇出任新撰组局长一职，负责取缔尊攘派志士的工作。
元治元年(1864年)六月五日，长州激进派维新志士在京都二条池田屋密谋火烧京都，趁乱暗杀佐幕派人物。不料消息泄露，近藤勇率新撰组进攻池田屋，将与会人物一网打尽，令长州派大伤元气。因为池田屋事件，新撰组一战成名，成为镇压尊攘派志士的急先锋。
庆应四年(1868年)，戊辰战争爆发。京都伏见鸟羽一战，幕府军大败，逃往江户，组织甲阳镇抚队。在甲裴胜沼、下总国流山一战中，为掩护其他新撰组队员及同志撤离，近藤勇向维新政府军投降。因为当时幕府是维新政府“朝敌”，近藤勇投降后，当局不许近藤勇以武士身份切腹自尽，而判其斩首，同年4月处斩。
庆应四年四月二十五日，在板桥平尾一里冢，近藤勇被斩首，时年三十五岁(虚岁)。