安政6年(1859年)10月，因安政大狱，吉田松阴被判处死刑。
文久元年(1861年)12月，久坂玄瑞和为了加强松下村塾学生为中心的长州志士的团结，创造了一灯钱申合这一组织(参加者有桂小五郎，高杉晋作，伊藤博文，山县有朋等24人)。
文久元年左右开始，久坂玄瑞和各藩的志士们交流变的活跃起来，特别是为长州、水户、萨摩、土佐的四藩的尊攘派结成同盟而努力，于是他称为了尊王攘夷运动以及反幕运动的中心人物。
因为长井雅乐的「航海远略策」，使得藩论向公武合体论倾斜，5月23日藩主采取长井雅乐的理论，把朝廷中的攘夷派给说服了。久坂玄瑞多次提出异议，企图改变藩论，但是同年和宫下嫁，公武合体的方案还是成功了。
久坂玄瑞于是转向组织“草莽志士纠合”，文久2年(1862年)正月14日，坂本龙马以剑术修道的名义，带着武市半平太的书信来到荻，和久坂玄瑞进行碰头。因为和马关的豪商白石正一郎关系不错，在白石家里设置了隐瞒的地下集会所。与萨摩藩的西乡隆盛、土佐藩的吉村寅太郎以及其他久留米藩、筑前藩的志士一起谋划大事。松门的同志一起立下血盟，桂小五郎则向藩主父子、重臣再度弹劾长井雅乐。于是久坂和同志在文久2年(1862年)4月一起上京并致力于扭转藩论。6月久坂玄瑞说袭击长井雅乐已经错失良机，应又向藩主提交长井雅乐的诉状和待罪书，但是他在京都比较谨慎。但是同时，桂小五郎成功劝说长州藩的藩主毛利敬亲攘夷成功，7月6日长井雅乐失势。
同年8月，久坂玄瑞向藩主提交《回澜建议》，藩主毛利敬亲采纳了这条建议，抛弃了航海远略策，《回澜建议》则成为了藩论。9月，他向全国的志士提出了行动纲领《解腕痴言》，主要意见是“不要向西方强大的武力而屈服的开国，而是奋起尽力对等的进行交涉，借此等到我国国力回复，武力整备后，再签订对等的条约。”这贯彻了他的老师吉田松阴一向的主张，并且力主权力从幕府回到朝廷手中。
同月，他解除了一向谨慎的态度，认为应当加速活动，与萨长土三藩的志士进行碰头，受到攘夷御下命的敕使的鼓励而下定决心。9月末和土佐藩的坂本龙马、福冈孝弟一起商议三藩组建近卫兵的事宜。接着和攘夷派的三条实美、姊小路公知结交好关系。
10月，与桂小五郎一起和督促幕府攘夷的勅使三条实美、姊小路公知进入江户，强迫幕府实施攘夷。对此，第二年幕府将军德川家茂上京接受了勅旨。