久坂玄瑞在京都提出“大和御幸(大和皇家视察)、御亲政”的《攘夷御亲征》的建白书，8月13日在亲长州派的公卿三条实美等大臣的尽力下，朝廷下达了该敕诏。但是与此同时幕府知道了擅自长州藩主持的激进攘夷派的举动，于是和会津藩、萨摩藩、中川宫朝彦亲王、其他公武合体派的公卿一起发动「八月十八日政变」，使得长州势力遭到朝廷一扫而空，长州藩也被解除了宫门警卫的职责，而孝明天皇也发出了“支持攘夷，反对倒幕”的意见。而久坂玄瑞暂时以京都诘政务座的身份留在京都并且图谋回复失地。在此期间，三条实美、真木和泉和来岛又兵卫等主张向京都进军的“进发论”，但是久坂玄瑞和桂小五郎阻止了这一举动。
第二年4月，久坂玄瑞想要乘萨摩藩的岛津久光、福井藩的松平春岳和宇和岛藩的伊达宗城离开京都的机会，让长州藩的世子毛利定广上京。
但是翌年的元治元年(1864年)6月5日(以下时间均为旧历)，池田屋事件的悲剧传到国内造成藩内向京都进攻的意见开始沸腾，久坂玄瑞在无法控制过热的藩内舆论下，不得已来岛又兵卫与真木和泉一起率领诸队东上，参与举兵。益田亲施、久坂玄瑞等人在山崎天王山、宝山，国司亲相、来岛又兵卫等人在嵯峨天龙寺，福原元僴在伏见长州屋敷集兵、布阵、扎营。24日他起草了《叹愿书》，引起各藩志士和朝廷中不少公卿的同情，但是7月12日萨摩藩的士兵到达京都后局势一下子发生了变化。
最终在7月18日，久坂玄瑞在男山八幡宫(石清水八幡神社)的本阵和20多名主要干部召开了最后的大会。久坂玄瑞坚持不应该违背朝廷的命令率兵进发，但是来岛又兵卫斥责道：“进军有什么可以犹豫的?”久坂玄瑞回答说：“这件事本来是为了洗刷君主无实的罪名，应该多次重申我们的请求。我们一开始就不想战斗。而且世子君马上就要来了，等一等他在决定要不要进攻比较合适。现在，我军进攻的话，不但没有援军，而且我军的准备也不充分，为了必胜，我们还是等到时机成熟再做了断比较好。”来岛又兵卫则呵斥道：“卑怯者”、“我就知道你这医生小子会拒绝。如果吝惜自己的性命而犹豫的话，就随便留在此处好了。其他的人助我一臂之力，消灭恶人!”之后离座而去。最年长的参谋的真木和泉也说“我同意来岛君的意见”，决定进攻。久坂玄瑞一言不发的离开座位回到天王山的本阵去了。
各藩增援京都的兵力有2万到3万，而长州藩只有不到两千人，因此这对长州藩来说是极大的挑战。
7月19日，来岛又兵卫率先领兵进攻蛤御门，结果指挥来岛又兵卫率部与会津藩的士兵交火的时候遭到萨摩藩士兵的夹击，来岛又兵卫遭到西乡隆盛指挥的部队的狙击而负伤，接着自杀身亡。来岛队的士兵顿时兵败如山倒。
虽然不情愿，但是久坂玄瑞还是真木和泉等人一起支援来岛又兵卫，但是由于来迟了一步，久坂玄瑞想要再度通过鹰司辅熙向朝廷发出申请书，于是率部向鹰司邸附近的堺町御门发动进攻，因为无法击败守卫大门的越前藩的军队，于是率领部队翻墙进入鹰司辅熙邸内，久坂玄瑞亲自请求鹰司辅熙再次帮助自己提交叹愿书(申请书)，但是遭到了拒绝，接着鹰司辅熙从久坂玄瑞手中挣脱逃走了。接着越前藩的士兵从会津藩手中借来了大炮轰击，长州藩的士兵开始四下溃散。在鹰司辅熙邸起火后，久坂玄瑞劝阻想要和他一起自杀的入江九一，“无论如何也要逃出重围，报告给世子君，让他不要接近京都。”但是入江九一刚从鹰司辅熙邸逃出来的时候，就被越前藩的士兵发现，一枪戳在脸上死去了。
最后留在鹰司邸内的久坂玄瑞和寺岛忠三郎一起互刺自杀身亡。享年25岁。
久坂玄瑞死后，因为发生大火，遗体最终也没得到确认。入江九一则和其他8名战死在鹰司邸附近的长州藩藩士一起，在获得松平春岳的许可下，被安葬在福井藩在京都的墓葬——上善寺，据说久坂玄瑞在也其中。
久坂玄瑞和妻子文之间没有孩子。因此他的连襟小田村伊之助将他和前妻寿(文的姐姐)之间的次子粂次郎过继给他作为养子，玄瑞死后粂次郎继承了久坂家。但是玄瑞在京都的时候和艺妓之间有了一个遗腹子，在明治维新后，这个孩子被承认了，被起名叫做秀次郎，继承了久坂家。后来在大仓组的台湾基隆支社工作。现在我们所熟知的久坂玄瑞的画像就是以秀次郎为原型所描绘的。
小田村伊之助此时改名为楫取素彦，而粂次郎则取名楫取道明，又回到并继承了楫取家。后来道明在台湾芝山岩事件中遭到杀害、作为「六氏先生」的一员被祭祀。道明的生母寿死后，他的父亲素彦和文再婚。