1860年5月，二破江南大营后，洪秀全接受洪仁玕的意见，乘胜东征苏、常。太平军主力集中于东线，湘军乘虚加强了对天京上游门户安庆的围困。9月下旬，洪秀全召集军事会议，决定以陈玉成、李秀成为主力沿长江两岸分进合击，于次年4月会师攻克武昌，以解安庆之围。
9月底，陈玉成即率军沿长江北岸转战安徽向西进击。可是长江南路的李秀成新获苏、常地盘后，对西征持消极态度。在洪秀全严词督促下才于10月下旬出发。西进时，他一心招兵买马扩大队伍，不惜绕道、滞留。陈玉成按期于1861年3月18日到达黄州(离汉口仅50英里)，而李秀成的队伍连影子也不见。安庆危急，陈玉成留下赖文光一部，自己率主力回师径援安庆。李秀成6月15日才到达黄州对岸的武昌县，见陈玉成东返，他也不战回师浙江。
李秀成的自私导致围武昌救安庆的第二次西征功亏一篑。
1861年4月底，陈玉成到达集贤关，随即派平西主将吴定彩率军入安庆助守。与此同时，天京方面也派援军进至安庆附近。5月1日干王洪仁玕、章王林绍璋、前军主将吴如孝等率军2万多人来援，次日大败于湘军，退守桐城。3日定南主将黄文金自芜湖率8000人渡江至桐城一线，会同林绍璋部及捻军2万人，准备后再战。6日、11日两战败北。清方完成打援后，对陈玉成部发动了总攻。5月上旬，陈玉成自集贤关多次攻击湘军营垒，但毫无进展。这时清方援军又至，为避免被敌围歼，19日留8000人守集贤关及菱湖两岸营垒，令靖东主将刘玱琳等4000人守关外赤岗岭四垒，要他们“死守待援”。自己带一支军队回桐城。
23日陈、洪、林、黄等率军共3万分三路强攻，敌方五路反击，太平军全线崩溃，再退桐城。与此同时，湘军猛攻集贤关外赤岗岭四垒，同时切断关内太平军退路。6月7日湘军以大炮猛轰，由于孤军无援，四面被围，9日赤岗岭四垒全部失陷。著名骁将刘玱琳、李仕福被俘遇难。接着菱湖两岸的营垒也相继被破，太平军8000人全部战死。此役陈玉成损失万余精锐，并且刘、李皆为陈手下的一流战将。8月，陈、林、黄同新来援的杨辅清，为救安庆做了最后一次努力，分三路大军联合进击，24日曾再次冲入集贤关猛攻曾国荃围城军后壕，安庆城内守军也“列队西门，遥遥相应”。
太平军猛攻十余次，终不能破。清军的长期围困，使安庆城内守军“米粮尽绝”。9月4日，湘军在北门引爆地道内的炸药，轰塌城墙，攻入城内。5日安庆沦陷。太平军守将叶芸来、吴定彩等和守城战士1万多人，惨遭屠杀。
会攻武昌不成，太平军被迫与清军在安庆决战，伤亡惨重，陈玉成部损失殆尽。后来洪仁玕沉痛地说：“我军最大之损失乃是安庆落在清军之手。此城实为天京锁钥而保障其安全者，一落在妖手，即可为攻我之基础。安庆一失，沿途至天京之城，相继陷落，不可复为矣。”
安庆失守后，陈玉成退守庐州，他派马融和、邱远才、陈得才和赖文光等率队赴西北，试图广招兵马，收复皖省。叛徒苗沛霖诱执陈玉成于寿州。面对敌人的劝降，陈玉成大义凛然道：“大丈夫死则死耳，何饶舌也。”1862年6月4日，陈玉成被凌迟处死于河南延津，时年26岁。英王殉国使太平天国栋梁摧折，正如他自述：“太平天国去我一人，江山也算去了一半。”自从天京事变以来，陈玉成无疑是天国长城。从二破江北大营到东征苏常，大江南北无处不驰骋着英王铁骑。他骁勇善战，无私无畏，屡任前锋，使敌闻风丧胆，连曾国藩也“深畏之”。如今“英王一去，军势军威，同时堕落，全部瓦解”。