公元前333年8月底，亚力山大征服小亚细亚腹地以后，立刻南下进军波斯帝国在小亚细亚最后的据点西里西亚(Cilicia)。波斯西里西亚总督阿萨姆(Arsames)继续诱敌深入，弃守金牛山脉上的险要山口，使得马其顿大军轻易进占首府塔苏斯(Tarsus)。与此同时，波斯王大流士亲率数十万大军从巴比伦出发，于9月初到达阿曼山脉东侧的索克依(Sochoi)严阵以待，打算利用这里的平原地形同亚力山大决战。
波斯行省西里西亚位于安纳托利亚半岛东南角，是小亚细亚进入两河平原的门户，这里有金牛山脉(Taurus Mountains)环绕西、北两面，东面是南北走向的阿曼山脉(Amanus Ranges)，山脉以东就是广袤的两河平原。阿曼山脉阻断了东西方向的交通，只有两个山口能够通行，一个是阿曼山口(Amanic Gate)，位于山脉北部的伊苏斯河谷(Issus Valley)附近，另一个是叙利亚山口(Syrian Gate)，在阿曼山口南面约100公里处。亚力山大到达西里西亚以后感染风寒卧床不起，修养了一个多月才复元。他派帕马尼奥率部南进，控制叙利亚山口，并打探波斯军队的动向。帕马尼奥军团在叙利亚山口西侧扎营，派出探马越过叙利亚山口向东侦查，很快发现驻扎在索克依的波斯大军。
亚力山大一向有料敌之先的能力，他接到帕马尼奥的探报，断定大流士将从南边的叙利亚山口通过。10月底，亚力山大将伤病员留在依苏斯的营地里，率领大部队向南行军60公里来到叙利亚山口，准备在这里利用地形阻击大流士的大军。正当亚力山大向叙利亚山口进军时，大流士却从索克依挥师北上，从阿曼山口顺利通过，占领了亚力山大留在伊苏斯的大营，俘虏了所有的伤兵员和物资，截断了亚力山大的后路。大流士将马其顿的伤病员全部剁去双手，放他们前去给亚力山大报信，然后从伊苏斯南进20公里，到皮纳罗河畔(Pinarus River)安营扎寨，严阵以待。伊苏斯战役就这样以亚力山大陷入绝境拉开序幕。
西方史学家考证，皮纳罗河就是今天的帕亚斯河(Payas River)。这条河发源于阿曼山脉，全长大约四公里，上游一公里多的河段在山谷中穿行;进入海岸平原最初的500米只能算是一条溪流;中游将近两公里的河段加宽到35米，河床上石头密布，河岸由于山洪冲刷而高耸陡峭，只有几处平缓地段可以涉渡;下游入海的500米河段比较平坦开阔。根据亚力山大的史官卡利斯蒂尼(Callisthenes)的记录，皮纳罗河谷平原的宽度不超过2.5公里，即使加上可以部署兵力的一段平缓山坡，整个战场的宽度不会超过三公里(现在的帕亚斯河谷平原宽3.5公里)。古典史料记载，大流士乘坐黄金打造的华丽战车高居波斯阵线中央，从战场上的任何位置都能看到他魁梧的身影。大流士身边簇拥着2千骑兵禁卫军，前面排列3万希腊雇佣军，组成中央阵营。由于战场狭窄，希腊雇佣军密集方阵的纵深达到24行。左翼阵营由4万的卡尔达克步兵和2万弓箭手组成，弓箭手部署在步兵方阵的后面。大流士特别派遣2万步兵在皮纳罗河以南依山列阵，对马其顿军队的右翼形成包抄之势。波斯右翼有2万卡尔达克步兵压阵，而事先渡河担任屏障的3万波斯骑兵在部署完毕以后全部退到右翼，占据皮纳罗河的下游河段。波斯骑兵统帅是纳巴扎尼(Nabarzanes)，他麾下的6千铁甲骑兵是大流士寄予厚望的突击部队。这样波斯军队在第一道防线总共部署15万人，在波斯阵线后面，还有数量不详的藩邦部队组成的第二道防线。
大流士的排兵布阵相当精明，唯一的败笔大概是将2千马迪亚(Mardian)弓箭手部署在波斯左翼重装步兵的前面。马迪亚人是来自伊朗高原西南部的游牧民族，以其优秀的弓箭手闻名波斯帝国。大流士这样布置大概是为了充分发挥马迪亚弓箭手快速准确的直射火力，以阻击马其顿骑兵的冲锋，但他显然高估了弓箭对马其顿重骑兵的杀伤力。轻装的马迪亚弓箭手根本不具备抗冲击能力，而他们身后的卡尔达克重装步兵排列成希腊风格的密集阵，并没有留下足够开阔的通道给弓箭手后撤。这个弱点将导致波斯左翼的崩溃。
后世史学家大多认为波斯军队的数量被过分夸大了。大流士的贴身卫队2千人应该没有水分;希腊雇佣军占据的阵线宽度不足一公里，按照24行的密集阵厚度计算，实际兵力应该不超过2万人。同样道理，左翼4万卡尔达克步兵和2万弓箭手实际兵力至少应该减半，即总共3万人。右翼波斯骑兵占据的战场宽度只有500米，无论如何容不下3万骑兵，后人估计参战的波斯骑兵最多不过一万人，其中至少一半是铁甲骑兵。这样估算波斯军队的一线兵力大约有7万人。
在大流士调兵遣将的同时，马其顿军队继续稳步前进，各个部队在行进当中按部就班进入指定的阵线位置。左翼阵营是帕米尼奥率领的马其顿密集阵共1万2千重装步兵，由6个团级方阵组成，指挥官分别是帕米尼奥之子尼卡诺(Nicanor)、科恩(Coenus)、柏蒂卡(Perdiccas)、美利格(Meleager)、托勒密(Ptolemy)、和阿铭塔(Amyntas)。密集阵最初是32行纵深，随着战场的变宽而不断向两翼展开，厚度先减为16行，再减为8行，以保持足够的正面宽度。密集阵前面是2千色雷斯标枪手和克里特弓箭手混编组成的散兵线，左边有600希腊联盟重骑兵保护侧翼。亚力山大照例亲率2千近卫骑兵组成右翼主力，左侧是3千近卫步兵衔接马其顿密集阵，右侧是1,800特萨利重骑兵和800马其顿轻骑兵，右翼远端是2千希腊联盟游击步兵和3千阿格里亚和色雷斯标枪手。亚力山大把希腊联盟重装步兵4千人作为预备队，大概是考虑到波斯军队里希腊雇佣军数量众多，害怕自己的希腊部队面对同胞不忍下手。此役马其顿参战部队总共3万2千人。
大流士布阵完毕，担任屏障的波斯骑兵迅速撤回本阵，亚力山大终于看到了波斯阵线的全貌。显然大流士和亚力山大英雄所见略同，兵力部署都是左弱右强，突击部队都放在右翼。马其顿密集阵面对波斯希腊雇佣军和卡尔达克步兵，处于一比三的兵力劣势，但波斯军队显然打算在这里取守势，他们在皮纳罗河北岸容易涉渡的地段埋置大量削尖的树桩，用于阻碍马其顿重装步兵的冲锋。这种缺乏信心的表现让马其顿步兵士气更加旺盛。马其顿密集阵的左侧是2千标枪手和弓箭手，以及600希腊重骑兵，他们面对波斯最精锐的部队 - 纳巴扎尼统帅的铁甲骑兵，实力对比非常悬殊。波斯左翼的2万卡尔达克重装步兵和1万弓箭手将接受马其顿近卫骑兵的考验，他们的任务是尽量抵挡和迟滞马其顿骑兵的突击。在马其顿阵线右侧山坡上还有数千波斯步兵，威胁着马其顿右翼阵线的侧后方。
亚力山大看到马其顿的左翼远端过于薄弱，立刻将右翼的1,800特萨利重骑兵调到左翼。这里亚力山大展现了高超的指挥艺术，他命令特萨利骑兵悄无声息地贴着马其顿密集阵的后面向左移动，大流士的视线被竖立如林的马其顿长矛遮挡，对这个调动毫无察觉。亚力山大并没有把特萨利骑兵部署在马其顿密集阵的左侧，而是让他们藏在方阵后面作为一支奇兵，接受帕米尼奥的指挥。这支奇兵在战役当中起到了非常关键的作用。接下来亚力山大派出两个营的近卫骑兵600人，在2千游击步兵和1千标枪手的支持下向右侧山坡上的波斯步兵发起攻击，以消除他们对马其顿侧翼的威胁。经过短暂的战斗，波斯步兵被迫放弃缓坡上的阵地，远远退到山麓之上。亚力山大随后派遣300轻骑兵留在山坡上监视警戒，将其他部队撤回本阵。
当马其顿军队前进到波斯军队的弓箭射程之外时，亚力山大下令部队原地稍息。他照例策马驰过马其顿阵线检阅部队，慷慨激昂地发表演说鼓舞士气。与此同时，波斯军队的将领们也在阵前向他们各自的部队大声训话，进行战前动员，各种语言的呼喊声此起彼伏，在河谷中回荡。马其顿将士群情激昂，发出惊天动地的“战吼”(War Cry)，波斯阵营不甘示弱，也以海啸般的吼叫回应，而数千面波斯战鼓开始擂响，震耳欲聋。伊苏斯战役一触即发。