施剑翘(当时名为施谷兰)从小受父亲宠爱，深居闺阁，还缠过足。虽然没有接受过正规教育，但在家中有私塾老师教授学问，对古文诗词颇感兴趣。13岁时当家管事，18岁时毕业于天津师范学校。1925年秋，奉系军阀张宗昌与直系军阀孙传芳为争夺安徽、江苏的地盘展开战争，时任奉系第二军军长、前敌总指挥的施从滨奉山东督办张宗昌之命迎头截击。施从滨率军南下时，孙传芳曾连发三封电报要施同他合作，但施不予理睬，反而孤军深入。在皖北固镇的交锋中兵败受俘，被孙传芳枭首于蚌埠车站，示众三日。后来施剑翘的三叔以同乡名义将施从滨尸首运回安徽桐城埋葬，并赶到天津给嫂子和侄女报信。死讯传来，年仅20岁的施剑翘就立志为父报仇，手刃仇人。
“被俘牺牲无公理，暴尸悬首灭人情。痛亲谁识儿心苦，誓报父仇不顾身。”这是1925年得悉父亲惨死的确切消息后，施剑翘所作明志诗的后四句。当时国内女权已经得到一定程度的伸张，但作为一个裹足女子，弟妹又都年幼，施剑翘先是将报仇的希望寄托在堂兄施中诚身上。依靠张宗昌的关系，施中诚得以担任烟台警备司令这一要职。但此后施中诚却反劝其打消复仇念头。施剑翘因此与施中诚断绝了兄妹关系。1928年，在施从滨遇害三周年的忌日上，痛苦施剑翘母女惊动了前来借宿的同乡人施靖公。此人时任山西军阀阎锡山部的谍报股长，是施中诚的军校同学。施靖公表示愿意承担报仇雪恨的大事，施剑翘遂下嫁于他，迁居太原。到了1935年，施靖公被提拔为旅长，而报仇之事却一拖再拖。施剑翘在要求施靖公为父报仇遭拒后，与其一刀两断，带着两个儿子返回娘家。同年，施剑翘有感于10年中空付许多心血而父仇未报，吟诗“翘首望明月，拔剑问青天”，并从此由“施谷兰”改名为“施剑翘”。并把两个儿子的名字由“大利”“二利”，分别改为“佥刃”和“羽尧”，组合起来便是“剑翘”。1935年，施剑翘的弟弟施则凡已从日本陆军士官学校毕业回国，他带回一把日本军刀，发誓要手刃孙传芳，被担心反将功亏一篑的施剑翘制止。1935年，施剑翘通过手术放开了裹着的双足，并练习枪法。之后，施剑翘打听到孙传芳兵败寓居天津的消息，于是前往天津。同年农历九月十七日——施剑翘的父亲遇难十周年这天，她到天津日租界观音寺为父亲举行纪念法会。从受邀前来的富明法师(富明大德)口中得知孙传芳已是天津佛教居士林的居士。施剑翘随后化名“董慧”，委托一位女居士介绍加入了居士林。施剑翘通过各种途径去了解孙传芳的身貌、口音及活动规律，知道他每周三、六必到居士林听经，随即做了刺杀的具体安排：将准备好的《告国人书》和遗嘱印制出来，打算在行刺后散发;并把11月13日(星期三)定为替父报仇的日子。1935年11月13日，正是讲经日，前来听经的孙传芳端坐在佛堂中央。施剑翘本在靠近火炉的后排座位，离孙传芳较远，她以背后的炉火太热为由要移到前排去。看堂人允诺后，施剑翘站起身来，伸手握住衣襟下的手枪，快步来到孙传芳身后。待众居士闭目随富明法师诵经，施剑翘悄悄拔出勃朗宁手枪，对准孙传芳的后脑勺射出了第一发子弹，紧接着又朝他的太阳穴和腰部各射一枪。枪声响后，佛堂大乱，施剑翘将提前准备好的《告国人书》和身穿将校服的施从滨照片抛向人群，大声宣布自己的姓名及行刺目的，并拨通了警察局的电话，决意自首。不久，施剑翘被前来的警察带走。施剑翘的长孙女施朝说：“奶奶的刺杀计划当时只跟她的大弟弟施则凡商量，本来施则凡也是要参与刺杀的，但奶奶觉得弟弟是家里的顶梁柱，不能再出什么意外。决定行刺前几天，她谁也没告诉，先是叫家人把外祖母送到南京，又将自己的两个孩子托给妹妹施韧兰照顾，她是抱着必死之心去的。”当天下午6时，《新天津报》发出号外，报道了“施从滨有女复仇，孙传芳佛堂毙命”的特大新闻。次日，天津、北平、上海等各报都以头号标题刊载了这一消息，全国轰动。
施剑翘刺杀孙传芳一案被移送到天津地方法院检察处。在侦讯中，施剑翘不讳事实，直陈了杀人经过和原因。按照当时的法律，施剑翘的行为应判处10年以上有期徒刑或者无期徒刑、死刑。在法庭上，施剑翘详细陈述了自己艰难的复仇历程，最后说道：“父亲如果战死在两军阵前，我不能拿孙传芳做仇人。他残杀俘虏，死后悬头，我才与他不共戴天。”这一案件，天津地方法院一审判决为有期徒刑10年。1936年4月13日，《新天津报》刊登了她在狱中写的文章《亲爱的同胞，赶快奋力兴起吧》。此谋杀案在当时引起极大轰动，报章、杂志争相报导，称赞她为“女中豪杰”“巾帼英雄”，要求政府特赦。1936年8月13日，经辩护律师代为申诉，施剑翘被河北省高等法院判处7年监禁。全国妇女会，江宁、扬州、江都妇女会，旅京安徽学会，安徽省立徽州师范等团体纷纷通电呼吁，希望最高法院能对施剑翘援例特赦。电文中有“况孙传芳曾南拒革命之师，又北窥齐鲁之境，今施剑翘之事，直接以复父仇，间接即除国憝”的语句。后冯玉祥同李烈钧、于右任、张继、宋哲元等人出面救援，呈请国民政府予以特赦。1936年10月14日，在施剑翘入狱11个月的时候，时任中华民国政府主席林森向全国发表公告，决定赦免施剑翘。此后，由中华民国最高法院下达特赦令，将施剑翘特赦释放。
特赦不久，施剑翘与母亲董氏、弟弟施则凡先在南京生活，后来又随施则凡前去湖南长沙。1937年，担任湖南抗敌后援总会慰劳组主任。1941年7月，施剑翘与母亲随弟弟施则凡到了四川合川县。目睹日本飞机肆意轰炸、百姓蒙受灾难的悲惨情景，她主动面见县长，请缨开展救灾工作。1942年，施剑翘发起捐献飞机的倡议，得到各界的响应，被选为献机委员会指导长，最终募得3架飞机的资金。为此宋美龄特地通过冯玉祥在重庆约见施剑翘，并邀她到全国妇女慰劳总会工作，被施剑翘婉言谢绝。1946年初，施剑翘在苏州的安徽同乡会馆创办私立从云小学，自任校长。从云小学招收的绝大多数是工人城市贫民子弟，也有部分孤儿和流浪小孩。1946年6月至1947年3月间，周恩来、邓颖超撤离南京到达上海。施剑翘为解决办学经费到沪上募捐，曾造访周恩来、邓颖超的居住地。在此期间，她和周恩来、邓颖超、董必武有过多次接触并逐渐与中国共产党建立了深厚感情。1949年4月27日，苏州解放，施剑翘率领学校师生走上街头扭起秧歌、敲起锣鼓，欢迎入城的解放军。当时解放战争仍在进行，施剑翘于是送两个儿子参加解放军，分别进入第二野战军及第三野战军的军政大学。1949年9月27日至10月8日，苏州市在乐群社召开首届各界人民代表会议，施剑翘当选了这次会议的代表。这一年，她当选为苏州市妇女联合会的副主席。1952年，施剑翘将倾其心力创办的从云小学移交给苏州市人民政府管理。此时疾病发作，她赴北京到协和医院检查，被诊断为子宫癌，手术后前往五台山疗养。同年移居北京，后以居士身份在碧云寺修行。1957年当选为北京市政协委员。1979年被确诊为晚期直肠癌，于当年的8月27日猝然去世，终年74岁。骨灰葬于苏州城西天灵公墓。临终时，施剑翘对小儿子施羽尧说：“娘老了，但还有一个心愿，如果健康许可，愿为祖国统一尽一份力量，宋美龄我见过，蒋经国我也见过，我盼望祖国早日统一。”