苏三娘原姓杨，是一个江湖卖艺女子，打飞镖百发百中，与苏三相识后便情投意合，结为夫妻。偶尔跟随苏三外出打仗，她善征勇战，智慧非凡，威风凛凛。她的丈夫苏三乃灵山天地会首领之一，他组织了一支强大的农民起义队伍，专与清政府作对，口号是“劫富济贫，杀官放囚”，因此得到广大贫苦群众的支持。苏三在道光三十年八月的一起战斗中，由于投机分子的出卖，被乱箭射死。随后，苏三娘率部加入太平天国，在这次历史上最大的农民起义中留下了辉煌的一页。
苏三经营运输业，是天地会的成员。婚后不久，苏三被同行杀害。他手下的一群年青的搬运工人和强悍的船夫劝说苏三娘出面，带领他们为苏三报仇。苏三娘带着他们到天地会请求帮助，天地会拨了500会众交由她指挥，不几天便杀了仇家，烧了凶手的家宅。于是苏三娘成了官府通缉的“女匪”。苏三娘从此拉起一支精壮的队伍，开始小规模武装起义，劫富济贫，锄强扶弱，驰骋于横县、钦州、灵山一带。队伍扩至数千人，她成为天地会的首领之一。
道光二十九年(1849)冬，她率天地会2000多人到武宣东乡墟加入太平军，参加金田起义，跟随洪秀全转战沙场，立下汗马功劳，位至女军军帅。在守永安、围桂林、打长沙、攻武汉、破南京等战役中，她英勇善战，所向披靡。连清朝当朝状元龙启瑞也为之倾倒，曾赋诗《苏三娘行》，赞她“两臂曾经百余战，一枪不落千人后”，“驰马呼曹意气豪”，“万千狐鼠纷藏逃”。1853年3月20日，她威风凛凛地率兵开进南京城时，龙诗写到：“城头鼓角声琅琅，牙卒林立旌旗张，东家西家走且僵，路人争看苏三娘。”
入南京城后，苏三娘曾任女营副总管，协助洪宣娇管理女营。咸丰三年(1853年)，苏三娘奉命与罗大纲各率男女军攻打镇江，战斗中她冲锋陷阵，飞身登城，其英雄事迹不胫而走，时有诗云：“绿旗黄幌女元戎，珠帽盘龙结束工;八百女兵都赤脚，蛮衿紥袴走如风。”
夺取镇江后，苏三娘又奉命镇守镇江，指挥女军多次粉碎了官兵的反扑。令人费解的是，咸丰四年(1854年)之后，威名赫赫的女将苏三娘从人们的视野中消失了，史籍中关于她的记载几乎不见了。《天国志·列女传》对她最后的记载是，“乙荣五年(太平天国历，即1855年)嫁与罗大纲，自后无闻”。
这个说法也得到了清人王韫(一说为王韬)的赞同，他在所著《瓮牖杂谈·贼中悍酋记》中提到，苏三娘到江南不久，就与罗大纲配为夫妇了。如果的确如此，这对同时率天地会
众投奔太平军的骁勇夫妻，可谓珠联璧合、相得益彰了。但也有另外两种说法：一是苏三娘坚守镇江两年多，直至天京陷落，在镇江保卫战中，为太平天国英勇捐躯;二是她在太平军定都南京后随即展开的北伐战争中，因孤军深入全军覆没，战死沙场。
然而遍查正史野史，这位当初天地会“广义堂”的女中豪杰、后来太平军的巾帼英雄，再没留下更多确凿的记载，似乎就此销声匿迹。苏三娘神秘地出现，又悄然隐去，给后人留下了一个个费解的谜。
在央视版《太平天国》中，苏三娘和罗大纲是水寇首领，且为夫妇，洪秀全在金田起义前将其劝入义军。1855年8月被湘军伏击，罗大纲死。苏三娘被包围后亦自杀。