赵贞吉于明武宗正德三年(1508年)十一月二十四日(12月16日)出生于四川内江桐梓坝，六岁时随祖父赵文杰于武功县读书，每日能读一卷书。年幼时与其弟赵蒙吉自相师友，互进其学，十五岁读王守仁《传习录》，惊曰： “予固疑物理之远于本也，今获所归矣。”(我本来怀疑万物的规律是远离本心的，现在才知道真正的归向。)欲往从王守仁治学，父母不许，遂遍诵六经自求之。十九岁习静般若寺，自号洞巾道人，适逢首辅杨廷和因大礼议之事惹怒明世宗朱厚熜，被罢职归乡，赵贞吉慨然兴叹： “孟子贤人也，孔子志梦周公，孟子志行王道，俱欲见诸行事，岂仅取为我忘情斯世哉!”遂立志学以致用，经邦济世，于是复攻举子业。嘉靖七年(1528年)，二十一岁的赵贞吉中四川省乡试第四， 《易经》房魁，为举人，率领本乡赴试者一同去新都拜谒杨廷和，杨廷和评价他说：“是将为社稷器，吾儿慎(指杨慎)弗逮也。”嘉靖八年(1529年)，下第归乡，会其母余太夫人故去。同年，王守仁、杨廷和相继过世，赵贞吉感于人世飘忽若是，遂兼修出世业，复习静古刹，“不栉沐解衣者数年”。(胡直·《少保赵文肃公传》)
嘉靖十四年(1535年)，赵贞吉二十八岁，其父强令其赴礼闱参加会试、殿试，中乙未科进士，都察院左都御史王廷相称赞他的对策文章，可与汉朝贾谊的《治安策》相媲美(都御使王公廷相抚其卷曰：“虽《治安策》弗能绝也。” )。内阁拟一甲第二名，朱厚熜嫌其语直，批：“略泛而滞于行。”置二甲第二，但不久就后悔了，于是首先选他为庶吉士，特旨留馆，读书中秘。嘉靖十五年(1536年)，授翰林院编修。嘉靖十七年(1538年)，赵贞吉因感朱厚熜初即位时锐意改革，去除积弊，而近年沉迷方术，朝政荒疏，于是上《乞求真儒疏》，但惹恼了执政者，因于是年秋请假归乡治学。 嘉靖二十年(1541年)，西北边地不宁，以副使身份随隆平侯张伟出使兰州，行持节册封事。嘉靖二十三年(1544年)，赵贞吉出教司礼监，并同修《会典》，充会试同考官。又升为右春坊右司允，管国子司业事。
嘉靖二十九年(1550年)，俺答进兵南下掳掠，直逼京师，谩书求贡，史称“庚戌之变”，朱厚熜召百官廷议，日中莫出一言，只有赵贞吉奋袖大言：“城下之盟，《春秋》耻之。且既许贡，则贼必入城要索不已，即内外夹攻，胡以御之?”并当场建言，宣谕诸将，散金犒士，以激励前线战事。朱厚熜对其颇为赞赏，并擢升他为左春坊左谕德兼河南道监察御史，奉敕宣谕诸军，并赐白金五万两，听随宜劳赏。因初时廷议罢，赵贞吉盛气谒见阁臣严嵩于西苑值房，严嵩辞而不见，赵贞吉遂斥骂门者。适逢赵文华趋入，赵贞吉复斥之，故严嵩大恨。及其撰敕时，故意不书令其督战之语，亦未遣一兵一卒为其护从。时敌骑往来频繁，赵贞吉独单骑出城(仅弟赵颐吉从之)，先诣总兵仇鸾营，因仇鸾阴与严嵩勾结，辞而不受。赵贞吉无奈，次驰入诸将营，宣谕犒士。次日入城复旨，入城前已撰有疏草，复请督战之权，而仇鸾畏其复至，使人为赵贞吉誊疏，故意拖延。及赵贞吉入，疏不来，独以宣谕事毕奏上。严嵩乘间激朱厚熜怒，谓赵贞吉“漫无区画”，下之诏狱，廷杖四十(《明世宗实录》记为杖五十，《明史窃》记载为杖九十)，谪广西庆远荔波典史。赵贞吉率妻子赴广西，至祁阳，得广西督学王敬所(王宗沐)翰谕。赵贞吉病且两月，计取道永州入粤，过飞雄岭中瘴，止存皮骨，与妻子相向而泣，是时颇为狼狈，智勇俱困，卒赖王敬所之眷顾，得置于安全之地，抵贬所已是春末夏初。嘉靖三十二年(1553年)六月，被量移为徽州通判。后累迁南京吏部主事、南京光禄寺少卿、右通政、南京光禄寺卿等职。嘉靖三十六年(1557年)，赵贞吉听闻三大殿灾，于是写信给执政严嵩，认为不应为了修殿而劳苦百姓。他因此惹恼严嵩。嘉靖三十八年(1559年)，赵贞吉的父亲赵勣谢世，他闻讣后归乡。嘉靖三十九年(1560年)，升任南京户部右侍郎，因已闻讣归，遂未到职。嘉靖四十年(1561年)，改任户部右侍郎，严嵩欲遣其往蓟州掌督运粮草之事，赵贞吉以为此事原已有人司职，徒增一职无益于事，故而拒绝，严嵩大怒，使人论劾，竟夺官去职。罢官归乡后，赵贞吉于内江桂湖街聚众讲学，从者甚众，并遍游内江各名胜寺庙，题诗刻石。嘉靖四十五年(1566年)，朱厚熜驾崩，赵贞吉痛哭，称：“先皇知我。”
隆庆元年(1567年)，新即位的明穆宗朱载垕起复赵贞吉为礼部侍郎兼翰林院学士，掌詹事府事务。八月，朱载垕亲临太学，当时国子祭酒胡杰刚离职，赵贞吉代其处理事务，讲《尚书·大禹谟》之《后克艰章》篇。赵贞吉年逾六十，议论侃直，进止有仪，颇受朱载垕关注。朱载垕又见其阐发有旨，音畅仪端，深为感动。不久后，赵贞吉补任经筵日讲官，被推举为南京礼部尚书。隆庆二年(1568年)三月，朱载垕又将赵贞吉留下，当经筵直讲。会文武边臣议，欲招南兵十万于张家湾。赵贞吉执意认为不可，当事者悟。复点会试总裁，奉命教吉士，仍充讲读编修，代祭孔子，为皇太子讲《唐太宗喻太子章》。隆庆三年(1569年)八月，赵贞吉以礼部尚书兼文渊阁大学士，入参机务，同诸阁臣入辅大政，协管詹事府事。隆庆四年(1570年)正月，加太子太保、荣禄大夫，赐蟒袍鸾带。二月，由首辅李春芳举荐，兼掌都察院事。会有俺答孙把汉阿吉等入降，赵贞吉力促和议。后因非例考察科道之事与辅臣高拱不协，上疏乞归，十二月解都察院事。
隆庆五年(1571年)初，致仕归，荫一子赵鼎柱为左府都事。抵家后，门人请设教于圣水寺。三月，隆庆和议成，朱载垕以赵贞吉曾与其议，特荫其子赵景柱为中书舍人。隆庆六年(1572年)五月，朱载垕驾崩，赵贞吉哭临至水浆不入，因哀毁过度而患嗽疾。万历二年(1574年)，其弟赵蒙吉谢世，赵贞吉伤弟之先逝，有迟暮之感，乃于是年卜葬地于“宝峰”。万历三年(1575年)，赵贞吉杜门谢客，不复会讲，汇秦汉而下三教遗言，作为内篇曰《经世通》 ，外篇曰《出世通》 ，汇三千年未经折衷之籍，聚为一书，作内外二篇都序。此书尚未撰成，至冬末，嗽疾复作，遂辍编。万历四年(1576年)三月十五日(4月13日)，赵贞吉端坐而逝，享年六十九岁。讣闻抵京师，明神宗朱翊钧为之辍朝一日，谕祭褒扬，谥号“文肃”，追赠少保。