追随刘邦
周昌是沛人，他和堂兄周苛都在秦时担任泗水卒史。 等到刘邦在沛县起兵的时候，打败了泗水郡的郡守、郡监，这样，周昌、周苛二兄弟也就以卒史的资历追随刘邦，刘邦命周昌担任一名管旗帜的职志，周苛暂时在帐下当宾客。 后来他们都跟从刘邦入关，推翻秦朝的统治。刘邦被封为汉王后，任命周苛为御史大夫，周昌为中尉。
汉王四年（前203），楚军在荥阳把刘邦团团围住，情况紧急，刘邦悄悄逃跑出围，命令周苛留守荥阳城。 楚军围荥阳，周苛以“反国之臣，难与共守”杀了魏豹。 楚军攻破了荥阳，想任命他为将领，周苛痛斥道：“你们这些人应该赶快投降汉王，不然的话，很快地就要做俘虏了！ ”项羽听罢大怒，立刻就烹杀了周苛。 于是，刘邦就拜周昌为御史大夫。周昌经常跟随汉王，并且多次击败项羽军。 因此，在高祖六年（前201）时，周昌和萧何、曹参一起受封，周昌被封为汾阴侯，周苛的儿子周成因父亲为国捐躯的原因，也被封为高景侯。
直言敢谏
周昌为人坚忍刚强，敢于直言不讳。自萧何、曹参等人对周昌都是非常敬畏的。 周昌曾经有一次在刘邦休息时进宫奏事，刘邦正和戚夫人拥抱，周昌见此情景，回头便跑，刘邦连忙上前追赶，追上之后，骑在周昌的脖子上问道：“你看我是什么样的皇帝？”周昌挺直脖子，昂起头说：“陛下您就是夏桀、商纣一样的皇帝。”刘邦听了哈哈大笑，但是却由此最敬畏周昌。
等到刘邦想废掉太子，立戚夫人之子如刘意为太子时，许多大臣都坚决反对，但是都未奏效。后来，幸好张良为吕后定下计策，使刘邦暂时把此事放下。 而周昌在朝廷中和刘邦极力争辩，刘邦问他理由何在，因为周昌本来就有口吃的毛病，再加上是在非常气愤的时候，也就口吃得更加厉害了，他说：“我的口才虽然不太好，但是我期……期……知道这样做是不行的。陛下您虽然想废掉太子，但是我期……期……坚决不能接受您的诏令。”高帝听罢，很高兴地笑了。事过之后，吕后因为在东厢侧耳听到上述对话，她见到周昌时，就跪谢说：“若不是您据理力争的话，太子几乎就被废掉了。”