戊戌变法失败后，光绪皇帝被慈禧太后囚禁。光绪皇帝在度过了10年没有人身自由的囚徒生活后，于光绪三十四年十月二十一日(1908年11月1日)死亡，终年三十八岁。
紧接着，第二天，即光绪三十四年十月二十二日，慈禧太后在仪鸾殿死亡。
在22小时之内，这对母子相继去世，死亡时间的诡异与巧合，光绪帝与慈禧之间早已存在的政治矛盾，不得不让人感觉，光绪帝的死亡背后，深藏着一个惊心而巨大的阴谋。由此，繁衍出种种猜测和议论。
第一种说法：慈禧知道自己即将归西天，不愿意在他死后，光绪皇帝重新掌权，派人毒死了光绪帝。主要依据有清末给光绪看病的名医屈桂庭他的回忆录中说：“光绪在临死前三天，在床上不停地翻滚，并且不停地大叫，‘肚子疼得不得了。’脸色发暗，舌头又黄又黑，明显是中毒症状。”根据这种说法，光绪是被毒死的，最大的嫌疑人是慈禧太后，因为她是当时最有权势，又严密控制光绪帝的，最好下毒、最可能下毒的人。
此说法的依据和记录有《清室外记》《清裨类钞》和《崇陵传信录》。
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第二种说法：袁世凯见慈禧一病难起，怕慈禧死后，光绪掌握实权，报复自已在戊戌变法出卖皇帝的行为，于是贿赂宫廷宦官，用剧毒药物害死光绪帝。这种说法最有权威的依据是清朝最后一个皇帝溥仪的说法，溥仪说：“我亲耳听到一个侍候光绪帝的老太监讲，光绪帝死前一天，只是用了一剂药，才变坏的。后来才知道这剂药是袁世凯送的。
第三种说法：太监李莲英得悉光绪帝的日记中载有西太后死后将诛袁世凯和他的消息，与慈禧一起阴谋将毒药投入光绪的食物中致使光绪帝中毒身亡。
第四种说法：这几年来有专家根据光绪帝生前的病历，结合当时的历史背景和现代中医学理论，推断是光绪帝因为严重肺结核病加上其他并发症，导致死亡的。
历史背景的根据是光绪二十五年正月初二日，太医朱琨等为光绪帝诊得脉案：“口渴思饮，喉痒呛咳，气不舒畅，心烦而悸，不耐事扰，时作太息。目中白睛红丝未净，视物蒙眬……耳内觉聋，时做轰声。胸中发堵，呼吸语言，丹田气觉不足……夜寐少眠，醒后筋脉觉僵，难以转侧……”
第五种说法：光绪帝有严重的肾亏，加上光绪帝从小身体虚弱，幼多病有长期遗精史。《病原述略》中说：“遗精之病将二十年，前数年每月必发十数次，近数年每月不过二三次……冬天较甚。近数年遗泄较少者，并非较愈，乃系肾经亏损太甚，无力发泄之故。光绪帝有这样一种病症，再加上从几岁起就受慈禧的压制，长期处在紧张之中，后来又在做皇帝时更是经历一连串的挫折和打击，病情逐渐加重，引起一系列呼吸道、消化道等并发病症，最后病亡。这一说法主要依据是光绪生前的病历和光绪生前自己的一段回忆。
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究竟哪一个说法更接近于事实呢?光绪帝的确切死因到底是什么?史学界关于光绪死因的辩论从未停止，怀疑谋杀说和正常死亡说几经交锋，却一直没能形成学术定论。
而据最新的研究认为，光绪帝是死于砒霜中毒。中国原子能研究院反应堆工程研究设计所、北京市公安局法医鉴定中心，先后提取了光绪分别长26厘米、65厘米的两小缕头发，清洗后晾干，剪成1厘米长的截段，逐一编号、称重和封装，然后用核分析方法逐段检测光绪头发中的元素含量。
结果显示，光绪头发中含有高浓度的元素砷，且各截段含量差异很大，第一缕头发的砷高峰值出现在第十段(2404微克/克);第二缕头发的砷高峰值出现在第二十六段(362.7微克/克)和第四十五段(202.1微克/克)。而同时对比测试的头发砷含量，当代人为0.14～0.59微克/克，与光绪同时代并埋在一起的隆裕皇后为9.20微克/克，清末一个草料官干尸头发为18.2微克/克。
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后来，又按照规范的法医检验要求和方法，提取了光绪遗骨及衣物样品测试，结果肩胛骨、脊椎骨和每件衣物的胃区部位、系带和领肩部位的含砷量很高;内层衣物的含砷量大大高于外层。再对光绪棺椁内、墓内物品和陵区水土等进行对比实验，结果表明光绪头发上的高浓度砷物质并非来自环境沾染。最后他们得出结论：光绪头发上的高含量砷并非为慢性中毒自然代谢产生，而是来自于外部沾染;大量的砷化合物曾存留于光绪尸体的胃腹部，尸体腐败过程进行再分布，侵蚀了遗骨、头发和衣物。而砷化合物也就是剧毒的砒霜。
经过科学测算，光绪摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。
按照这一研究，那么就与第一种说法一致——光绪帝是被谋杀的，那么谋害他的最大犯罪嫌疑人就是慈禧。