沙俄侵略军被迫撤离雅克萨后，贼心不死，继续拼凑兵力，图谋再犯。康熙二十四年(1685年)秋，莫斯科派兵600增援尼布楚。当获知清军撤走时，侵略军头目托尔布津率大批沙俄侵略军再次窜到雅克萨。俄军这一背信弃义的行为引起清政府的极大愤慨。次年初，康熙接到奏报，即下令反击。
七月二十四日，清军2000多人进抵雅克萨城下，将城围困起来，勒令沙俄侵略军投降。托尔布津不理。八月，清军开始攻城，托尔布津中弹身亡，改由杯敦代行指挥，继续顽抗。八月二十五日，清军考虑到沙俄侵略者死守雅克萨，必待援兵，且考虑隆冬冰合后，舰船行动、马匹粮秣等不便，于是在雅克萨城的南、北、东三面掘壕围困，在城西河上派战舰巡逻，切断守敌外援。侵略军被围困近年，战死病死很多，826名侵略军，最后只剩66人。雅克萨城旦夕可下，沙皇急忙向清请求撤围，遣使议定边界。清答应所请，准许侵略军残部撤往尼布楚。雅克萨反击战结束后，双方于康熙二十八年(1689年)七月二十四日缔结了《中俄尼布楚条约》，规定以外兴安岭至海，格尔必齐河和额尔古纳河为中俄两国东段边界。黑龙江以北，外兴安岭以南和乌苏里江以东地区均为清朝领土。
此仗直接遏制了沙俄的东扩，彼得一世大为震惊(此时他刚刚掌权)，不得不将进攻方向由“东扩”改为“西进”，为夺取波罗的海和黑海出海口而努力。